Фаза «первичного опустошения»
На 5 сутки после облучения уровень большинства форменных элементов в крови начинает падать – наступает фаза «первичного опустошения» .
Клинически эта фаза проявляется при снижении содержания клеток до критически низкого уровня. Это время и определяет продолжительность скрытого периода.
Определение дозы
общего облучения организма по содержанию лейкоцитов в периферической крови на 7-9 сутки после облучения
Продолжительность скрытого периода тем меньше, чем выше доза
облучения:
При лёгкой форме ОЛБ скрытый период может закончиться через 30 и более суток;
При средней форме – через 15-30 суток;
При тяжелой форме – через 5-20 суток;
При крайне тяжёлой форме – скрытый период может отсутствовать.
III.Период разгара.
Наступает при падении числа клеток крови ниже критического уровня:
Кроме этого наблюдается:
токсемия,
преобладание катаболизма над анаболизмом,
вегетативная дистония,
аутоиммунные поражения.
Но основу поражения составляет нарушение кроветворной функции.
IV. Период восстановления
Если в период разгара не наступает смерть
регенераторные процессы в кроветворной системе приводят к увеличению числа зрелых клеток крови
происходит ликвидация симптоматики периода разгара.
В течение этого периода происходит полная или частичная нормализация функций критических систем организма.
Прогноз для жизни при ОЛБ:
Легкой степени – благоприятный;
Средней степени – благоприятный при проведении надлежащего лечения;
Тяжелой степени – сомнительный, даже интенсивная комплексная терапия не всегда оказывается успешной. 
Трудоспособность при ОЛБ:
Легкая степень – сохраняется. В течение 2-го месяца болезни требуется ограничение тяжёлого физического труда;
Средняя степень - к началу 3-го месяца болезни возможно возвращение к лёгкому труду, а через год – к обычной деятельности;
Тяжёлая степень - работоспособность полностью не восстанавливается. Лёгкий труд возможен с 4-го месяца болезни.
Кишечная форма ОЛБ:
При общем облучении в дозе 10-20 Гр развивается кишечная форма ОЛБ, основу которой составляет кишечный синдром.
Он связан с повреждением и гибелью клеток эпителия тонкой кишки. Следствием этого повреждения является:
прекращение резорбции из просвета тонкой кишки воды и
электролитов
развивается дегидратация;нарушение барьерной функции кишечной стенки
токсичные вещества (токсины кишечной палочки) поступают
в кровь и лимфу
В период разгара кишечной формы ОЛБ:
ухудшается самочувствие,
развивается диарея,
повышается температура тела,
развивается орофарингеального синдром,
обезвоживание,
интоксикация,
эндогенная инфекция.
При условии лечения поражённые с кишечной формой ОЛБ могут прожить до двух и даже двух с половиной недель. Причинами смерти могут быть:
Панцитопенический синдром;
Присоединение вторичной инфекции;
Гибель комических кораблей - это всегда трагедия национального масштаба. Несмотря на то, что большинство подобных аварий происходило в США, к сожалению, случались они и у нас. Самой громкой стала гибель экипажа Союза-11.
Стыковка не состоялась
В апреле 1971 года Советский Союз вывел на орбиту первую в мире орбитальную станцию «Салют-1». Вскоре 24 апреля 1971 года к станции пристыковался «Союз-10» с тремя космонавтами на борту. Но, техника повела себя не так, как планировалось и экипаж космического корабля не смог перейти на борт станции. Пришлось возвращаться на Землю. После исправления технических ошибок был назначен следующий старт экипажа в составе Алексея Леонова , Валерия Кубасова и Петра Колодина. Однако их полет не состоялся из-за неожиданно вскрывшихся проблем со здоровьем у Валерия Кубасова. По правилам должен был лететь дублирующий экипаж: Георгий Добровольский, Владислав Волков и Виктор Пацаев . Во время полета космонавты должны были провести попытку повторной стыковки с «Салютом-1» и отремонтировать не сработавшие во время попытки предыдущей попытки узлы. При этом снятый с полета экипаж был крайне расстроен, ведь Алексей Леонов уже видел себя командиром первой в мире орбитальной станции. Тем не менее, экипаж Георгия Добровольского отправился на орбиту, а Алексея Леонова, домой, в Москву.
«Салют-1»
Во второй раз стыковка прошла удачно, но во все время пребывания космонавтов на станции они были вынуждены постоянно бороться с неприятными инцидентами. Однажды даже произошло возгорание. Волков предложил сразу перейти в спускаемый модуль, о чем предупредил Москву, но Добровольский с Пацаевым проявили решительность и успешно устранили неисправность. На станции космонавты провели 23 дня, установив очередной рекорд по продолжительности полета. Проблемы с техникой продолжились во время подготовки возвращения на Землю. Перед расстыковкой «Союза-11» и «Салюта-1» неожиданно загорелся датчик сообщавший, что люк негерметичен. В течение нескольких томительных минут космонавты, пытаясь устранить неисправность производили повторное закрытие люка. Наконец датчик, свидетельствующий о неисправности, погас, и модуль устремился к Земле. Однако во время спуска экипаж на связь с центром управления полетов не выходил. Приземлился модуль в автоматическом режиме. Предчувствуя недоброе, спасатели бросились вынимать из посадочного модуля космонавтов. К сожалению, все они были мертвы.
Причины трагедии
Первый осмотр посадочного модуля показал, что все системы работали штатно, кроме вентиляционного клапана через который поступал воздух. Он открылся раньше расчетного времени, когда модуль еще находился в космическом вакууме. Давление в капсуле с космонавтами упало, воздух улетучился, а спустя около двух минут у членов экипажа остановились сердца. Причем космонавты сразу поняли, что произошло и пытались закрыть злополучный клапан, но не успели. На устранение неисправности у них было всего 20 секунд, которых, конечно, не хватило. Причину нештатного открытия клапана правительственная комиссия списала на случайность и непредвиденные обстоятельства.
Атмосфера на нашей планете, расстояние до солнца и множество других невероятных совпадений привели к тому, что на Земле может существовать жизнь в том виде, как мы её знаем. Всё это воспринимается нами как данность, и мы, спеша на работу или отдыхая за столиком в кафе, не находим ничего удивительного в нашем существовании. Но всё хорошее когда-нибудь кончается. Однажды Земля станет непригодной для поддержания той жизни, которую мы знаем. Может быть, этого не случится еще миллионы лет. Но астрофизика нам подсказывает, что катастрофа может произойти в любой момент. И учёные нашли немало причин, по которым Земля может стать безжизненной.
1) Ядро планеты остынет
Земля окружена магнитным полем, называемым магнитосферой, которая защищает нас от солнечного ветра.
Это поле создаётся благодаря вращению планеты, из-за которого жидкая железоникелевая оболочка (внешнее ядро) движется вокруг твердой металлической сердцевины (внутреннего ядра), образуя гигантский магнитный генератор.
Магнитосфера отклоняет энергетические частицы, испускаемые солнцем, изменяет их размер и форму.
Если ядро планеты остынет, то мы потеряем нашу магнитосферу – а также защиту от солнечного ветра, из-за чего он постепенно разнесёт атмосферу Земли по всему космосу.
Марс, у которого когда-то была вода и атмосфера, несколько миллионов лет назад постигла именно такая участь, и он превратился в сухой и безжизненный мир, каким мы его знаем теперь.
2) Произойдёт расширение Солнца
Солнце, а особенно наше расстояние до него – это, пожалуй, самый важный фактор, благодаря которому стало возможно существование жизни.
Однако Солнце – звезда. А звёзды умирают.
Прямо сейчас Солнце находится в середине своего жизненного пути, постоянно превращая водород в гелий при помощи термоядерных реакций.
Но это не может длиться вечно. Через несколько миллиардов лет водород в ядре Солнца закончится, и оно начнёт перерабатывать гелий.
Из-за того, что переработка гелия даёт гораздо больше энергии, Солнце начнёт расширяться, и, возможно – притягивать Землю к себе.
Мы сгорим и испаримся.
Либо так, либо расширение солнца напротив, оттолкнёт Землю, она сойдет со своей орбиты и будет обречена скитаться по космосу как планета-странник – мёртвым куском холодного камня.
3) Земля столкнётся с планетой-странником
В космосе немало планет, которые перемещаются по нему свободно, а не вращаются вокруг звезды. Планеты достаточно часто оказываются выкинуты из своих звёздных систем во время их формирования.
Недавние расчёты показывают, что количество планет-странников в Млечном Пути превосходит количество звёзд в 100 000 раз.
Одна из таких планет может приблизиться к Земле и опасно дестабилизировать её орбиту.
Или бродячая планета может столкнуться с Землёй. Причём такое уже случалось – около 4,5 млн. лет назад маленькая планета столкнулась с более крупной, что сформировало Землю и Луну такими, как мы их знаем.
4) Земля столкнётся с астероидом
В Голливуде очень любят такие сценарии.
Камни из космоса могут быть очень разрушительными – уничтожил же один из них динозавров. Хотя, конечно, для того, чтобы уничтожить планету полностью нужно гораздо больше астероидов.
Но это всё равно может произойти. Например, в течение сотен миллионов лет с момента формирования Земли астероиды сталкивались с ней очень часто. Удары были так сильны, что океаны кипели годами, а температура воздуха была выше 500 градусов по Цельсию. Жизнь на Земле тогда была одноклеточной, и была представлена в виде особо жаростойких микробов. Большая часть современных форм жизни такого бы не перенесла.
5) Земля может сблизиться с блуждающей чёрной дырой
Чёрные дыры, пожалуй, вторая по популярности в Голливуде причина смерти планеты. Легко понять почему.
Они загадочные и пугающие. Даже само их название звучит жутковато.
Мы немногое знаем о чёрных дырах, зато знаем, что они настолько массивны, что даже свет не может вырваться за пределы их горизонта событий.
Также учёные знают, что существуют чёрные дыры, свободно путешествующие по космосу. Так что не исключено, что одна из них может навестить и Солнечную систему.
Если уж свет не может вырваться из чёрной дыры, то Земля уж точно не сможет. Есть две теории того, что произойдёт с планетой после того, как она пересечёт точку невозврата достаточно большой чёрной дыры. Менее крупная просто растянет (как говорят астрофизики, «спагеттифицирует») планету.
Некоторые физики говорят, что за горизонтом событий атомы будут растягиваться до тех пор, пока не уничтожаться полностью.
Иные – что мы попадём в другую часть вселенной, а то и в другое измерение.
Но, даже если чёрная дыра не затянет в себя Землю, то пройдя достаточно близко, она может вызвать землетрясения и другие стихийные бедствия или нарушить орбиту планеты, так что мы либо покинем солнечную систему, либо упадём на Солнце.
6) Земля будет уничтожена всплеском гамма-излучения
Всплески гамма-излучения (или просто гамма-всплески) – одни из самых мощных явлений во вселенной.
Многие из них – результат коллапса звезды во время её смерти. Один короткий всплеск может содержать больше энергии, чем Солнце может выработать за всю свою жизнь.
Такой мощный поток энергии может лишить Землю озонового слоя, сделав нас беззащитными перед опасным ультрафиолетовым излучением, и запустить механизм быстрого глобального похолодания.
Гамма-всплеск, попавший в Землю 440 млн. лет назад, мог быть причиной первого массового вымирания.
Но, к счастью, Дэвид Томпсон, заместитель руководитель проекта по наблюдению за гамма-излучением, сказал, что гамма-всплески на самом деле не очень опасны.
Он сказал, что шанс того, что Земля попадёт в поток гамма-всплеска, примерно равен «шансу того, что я встречу полярного медведя у себя в туалете».
7) Вселенная распадётся на части в своём последнем «Большом Разрыве»
Это то, что может уничтожить всю вселенную, не только Землю.
Суть вот в чём: неизвестная сила, называемая тёмной энергией, заставляет вселенную расширяться всё быстрее и быстрее.
Если расширение продолжится (что очень возможно), через 22 миллиарда лет межатомные связи ослабнут, и вся материя во вселенной постепенно рассеется в виде энергии.
Но если предположить, что Большого разрыва всё же не случится, то что может произойти после глобальной катастрофы, которую не переживёт человечество?
Вполне возможно, что выживут некоторые микробы, из которых потом вновь разовьётся жизнь.
Но если уничтожение будет абсолютным, то, на крайний случай, мы можем надеяться, что где-то во вселенной есть другая разумная жизнь, которая сможет отдать нам последние почести.
Почему люди умирают? Этот вопрос когда-то волновал умы мудрецов, жрецов, правителей и монахов так же, как и сейчас волнует многих медиков, ученых-биологов, генетиков, религиозных деятелей. Почему люди рано умирают (а рано - это для кого-то в 20, а для другого - в 80 или 90 лет) - вопрос риторический. Есть несколько точек зрения, каждый волен придерживаться той, что ему ближе.
Что такое смерть?
Почему люди умирают? Все просто и цинично - потому что мир устроен так, и никак иначе. Есть стадии появления или рождения, развития и роста, расцвета или зрелости, старения или угасания и гибели. Эти этапы проживает каждое живое существо - так учат на уроках биологии еще в школе. Но кроме этого, эти же стадии характерны и для любых процессов и объектов неживой природы, и даже социальных институтов. Все дело только в длительности перехода от одного жизненного этапа к другому. Можно сказать с полной уверенностью, что ничто в физическом мире не существует вечно.
Исключением не является и человек. Законы мироздания распространяются на человека разумного (Homo Sapiens), который все же значительно отличается и от своих предшественников (неандертальца или человека умелого, человека прямоходящего), и от животных. Все люди появляются на свет, растут и развиваются, размножаются, стареют и, в конце концов, умирают. Получается, что смерть - это завершение жизни, но не ее противоположность. Если говорить о противоположности смерти как процесса, то, скорее, это будет рождение.
Так почему человек рождается и умирает? Просто потому, что так устроен мир. Потому что старое должно уступать место новому, оставаясь в прошлом. Человек приходит из ниоткуда и уходит в никуда, получается, что жизнь - это только вспышка, мгновение в вечности.
Смерть с точки зрения религиозных учений
Почему должны умереть люди? С точки зрения множества религиозных учений, смерть отнюдь не является завершением. Абсолютно все мировые религии утверждают, что в человеке есть что-то незримое, вечное и ничем неуничтожимое. Это ментальная оболочка, душа, тогда как тело - оболочка физическая.
Каждый человек, согласно религии, приходит в этот мир, чтобы выполнить определенную миссию, дело всей жизни, которое у каждого свое. Кому-то суждено искупать грехи прошлых жизней и в этой жизни нищенствовать или болеть, кто-то получает награду за прошлые свои великие (с моральной точки зрения) свершения, например, помощь голодным и обездоленным, и может не беспокоиться об удовлетворении своих основных потребностей в этой жизни, развиваться духовно.
Потом душа возвращается обратно к Создателю - его каждая религия называет по-разному. В исламе, например, это Аллах, в индуизме - Ишвара, в православии - Бог-отец, Бог-сын и Святой Дух, а вот буддизм отвергает идею существования единого Бога. В язычестве, античном мире и праиндоевропейской религии отцом всего живого, создателем и творцом был Демиург.
Смерть по религиозной концепции - это переход из одного состояния в другое, рождение в новую жизнь. После смерти душа не гибнет, а продолжает существовать, только уже вне физического (земного) тела. В разных учениях представления о том, что происходит после смерти, различны, но все религии сходятся в том, что смерть - это не конец.
Уход из жизни с научной точки зрения
С точки зрения современной науки, смерть - это механизм, придуманный природой, который обеспечивает смену поколений и защищает планету от перенаселения. Смерть - это остановка всех биологических процессов, которые протекают в организме человека при жизни. Но ведь причин этой остановки очень и очень много. Люди умирают не только от болезней, но и от несчастных случаев или от рук других людей. Если всего этого удается избежать, то человек умирает от старости, то есть естественной смертью.
Что такое естественная смерть?
Естественная смерть - это смерть человека от старости. Что это значит? С возрастом активность клеток снижается, все процессы, происходящие в организме, начинают угасать. Иммунологи утверждают, что естественная смерть наступает по той причине, что начинают свое действие аутоиммунные процессы.
В норме в молодом и зрелом возрасте организм человека «закодирован» на борьбу против смерти. Это выражается, например, в том, что после употребления чрезмерного количества алкоголя человеку становится плохо. Организм реагирует на яд и пытается вывести его как можно скорее, посылает сигналы о том, что нельзя употреблять такие напитки. Хочет жить не только сознание человека, но и тело, поэтому организм в норме сам борется с инфекциями, ядами и другими негативными воздействиями.
С годами, а иногда и в молодом возрасте вследствие различных заболеваний начинают развиваться аутоиммунные процессы. Иммунная система перестает распознавать чужеродные объекты, она начинает принимать «своих» за «чужих». То есть организм начинает саморазрушаться, атаковать собственные клетки. Именно так объясняется естественная смерть от старости.
Основные причины смертности
Почему люди умирают молодыми или просто раньше времени? Это происходит, как уже упоминалось выше, из-за несчастных случаев, болезней или от рук других людей. Согласно данным ВОЗ, большая часть людей (54%) умирает из-за причин, список которых можно ограничить 10 пунктами. Так, больше всего человеческих жизней уносит инсульт и ишемическая болезнь сердца - это ведущие причины смертности в мире. На втором месте - ХОБЛ (обструктивная болезнь легких). Далее - рак легких, трахеи и бронхов, диабет, инфекции нижних дыхательных путей, диарейные болезни, туберкулез, ВИЧ/СПИД и... ДТП.
Почему иногда умирают во сне?
Почему люди умирают во сне? Действительно, очень многие покидают сей мир во сне: человек засыпает и больше не просыпается. Это объясняется довольно просто и логически. Человек треть своей жизни проводит во сне, так что уход из жизни в момент такого отдыха - явление столь же естественное, как и смерть наяву. Есть этому факту и вполне научное объяснение. Кардиологи говорят, что во время сна или просто в горизонтальном положении увеличивает приток венозной крови к сердцу, так что мышце требуется больше кислорода, а больное сердце и так плохо справляется со своей работой, и не выдерживает нагрузки. Именно поэтому рекомендуют больного во время приступа не укладывать, а оставить в полусидячем положении.
Преждевременная смерть
Почему люди умирают раньше времени? Помимо несчастных случаев, различных болезней и других факторов, врачи называют среди причин синдром внезапной и необъяснимой смерти. Иногда ведь случается так, что умирает относительно здоровый молодой человек. От чего? В таких случаях причину объясняют как раз этим синдромом, природа которого не до конца ясна современной науке. Известно, что больше подвержены этому синдрому мужчины, чем женщины. Возраст - от 20 до 49 лет. Кроме того, с монголоидами это случается чаще, чем с представителями других рас. Чаще всего синдромом внезапной смерти называют не те случаи, которые можно списать на злоупотребление алкоголем, наркотиками или курением, лишний вес и заболевания. Причем и вскрытие, как правило, не дает никаких объяснений. Свидетели утверждают, что человек, который умер от СВНС, во сне вдруг начинал сопеть, стонать, задыхаться и умирал. Если человека будили, в течение ближайшего часа или суток (в 94% случаев) он все равно умирал.
Почему умирает Россия
Почему люди умирают в России? Причины смертности в России во многом соответствуют тем, что представлены ВОЗ. Больше всего людей умирает от заболеваний системы кровообращение, ишемии и инсультов, новообразований, болезней органов дыхания и пищеварения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.15:576.367
Акадезин вызывает неапоптотическую гибель опухолевых клеток
В. А. Глазунова1*, К. В. Лобанов2, Р. С. Шакулов2, А. С. Миронов2, А. А. Штиль1 "Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478, Москва, Каширское ш., 24
■Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545, Москва, Дорожный пр-д, 1 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 27.12.2012
РЕФЕРАТ Изучено действие акадезина (5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-0-О-рибофуранозид) на опухолевые и неопухолевые клетки различного видового и тканевого происхождения. Установлено, что акадезин вызывает неапоптотическую гибель опухолевых клеток; чувствительность неопухолевых клеток к действию этого соединения существенно ниже. Акадезин вызывает гибель опухолевых клеток с фенотипом лекарственной устойчивости, обусловленной экспрессией транспортера Р-гликопротеина и инактивацией проапоптотического белка р53. Необходимым условием гибели клеток является активность транспортеров аденозина, тогда как функция АМР-активируемой протеинкиназы не требуется. Преимущественная гибель опухолевых клеток под действием акадезина и особенности механизма его цитотоксичности обусловливают перспективность этого соединения в качестве противоопухолевого средства. ключевые слова акадезин, гибель клеток, опухолевые клетки.
введение
Акадезин (5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-Р-О-рибофуранозид, АИКАР) проходит клинические испытания в качестве препарата для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза . Важное свойство акадезина - его преимущественная токсичность для опухолевых клеток при менее выраженном повреждении неопухолевых . Ранее показали, что акадезин способен стимулировать АМР-активируемую протеинкиназу (АМРК) -важный регулятор энергетического баланса клетки, контролирующий окисление жирных кислот, метаболизм глюкозы, синтез белков, жирных кислот и холестерина . Механизм действия акадезина обусловлен его фосфорилированием аденозинкиназой с образованием ZMP (5-амино-4-имидазолкарбоксамидриботида) - промежуточного продукта de novo-синтеза пуриновых оснований . ZMP, имитируя метаболические эффекты АМР, способен активировать АМРК. Противоопухолевое действие акадезина связывают с индукцией апоптоза . Вместе с тем имеются данные о неапоп-тотической гибели клеток и АМРК-независимом механизме действия акадезина на опухолевые клетки .
В настоящей работе изучено действие акадезина на клетки млекопитающих. Показано, что акадезин вызывает гибель опухолевых клеток различного тка-
невого происхождения, в том числе клеток, устойчивых к ряду противоопухолевых средств. Механизмы гибели клеток отличаются от апоптоза; их важной особенностью оказывается необходимость транспорта аденозина. Неопухолевые клетки менее чувствительны к действию акадезина. Избирательность ци-тотоксического действия и особенности механизмов гибели опухолевых клеток могут быть важными факторами, определяющими перспективность использования акадезина в терапии опухолей.
экспериментальная ЧАСТЬ
В экспериментах использовали следующие линии клеток человека: НСТ116 (аденокарцинома толстой кишки), НСТ116р53КО (изогенная сублиния, в которой не функционирует р53), К562 (промиелоцитар-ный лейкоз), К562/4 (сублиния, полученная после селекции на выживание в присутствии доксорубицина; экспрессирован белок множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) P-гликопротеин; Pgp), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы), MCF-7Dox (сублиния после селекции на выживание в присутствии доксорубицина; фенотип Pgp-опосредованной МЛУ), культуру фибробластов ПФЧ-2, лимфоциты крови здоровых доноров, а также клетки мыши: Р388 (лимфоцитарный лейкоз) и Sp2/0 (миелома). Реактивы приобретены в фирме «ПанЭко», Россия (кроме особо оговоренных случаев). Клетки культивировали в мо-
дифицированной Дульбекко среде Игла с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Bio-Whittaker, Австрия), 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С, 5% СО2 в увлажненной атмосфере. В экспериментах использовали культуры в логарифмической фазе роста. Лимфоциты выделяли из периферической крови доноров центрифугированием в градиенте плотности фиколла-урографина (d = 1.077 г/см3).
Акадезин получали в ГосНИИГенетика микробиологическим способом с использованием оригинального рекомбинантного штамма . Кроме того, оценивали цитотоксичность акадезина фирмы Sigma. В этой же фирме приобретены дипиридамол - ингибитор рецепторов аденозина , 5-йодтубер-цидин - ингибитор аденозинкиназы, препятствующий превращению акадезина в ZMP, и zVAD-fmk (карбобензоксивалилаланил-аспартил--фторметилкетон) - пан-каспазный ингибитор. Все соединения растворяли в диметилсульфоксиде или воде (10-20 мМ) и хранили при -20°С. В день опыта готовили разведения препарата в культуральной среде. Для оценки цитотоксичности акаде-зина использовали МТТ-тест, окраску клеток йодидом пропидия и аннексином V, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), определение
клеточного цикла в проточной цитофлуориметрии и электрофоретический анализ целостности геномной ДHK . В отдельных опытах препаратом сравнения служил алкильный катионный глицеро-липид гас-П-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)проп-1-илоксикарбонил]бутил}-№-метилимидазолийиодид, индуктор апоптоза .
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Преимущественная чувствительность опухолевых клеток к акадезину
В предварительных экспериментах мы установили, что препарат акадезина, полученный микробиологическим способом, и коммерческий акадезин идентичны по физико-химическим свойствам, чистоте, стабильности при хранении и цитотоксичности (данные не приведены). Для дальнейших исследований использовали акадезин, полученный авторским способом. В табл. 1 представлена цитотоксичность акадезина для трансформированных и нетрансфор-мированных клеток (культивируемых или свежевыделенных) различного видового и тканевого происхождения.
Из данных, представленных в табл. 1, следует, что к действию акадезина наиболее чувствительны
Таблица 1. Цитотоксичность акадезина для клеток млекопитающих
^етки Акадезин, мМ
G G.125 G.25 G.5 1.G 2.G
K562 1GG* 1GG 70 46 9 G
P388 1GG 36 30 20 9 G
Sp2/0 1GG 34 29 14 G G
K562/4 1GG 1GG 72 42 8 G
MCF-7 1GG 1GG 82 50 15 2
MCF-7Dox 1GG 1GG 86 48 17 1
HCT116 1GG 1GG 50 36 23 G
HCT116p53KO 1GG 1GG 54 34 25 G
ПФЧ-2, пролиферирующие 1GG 1GG 1GG 96 96 86
ПФЧ-2, непролиферирующие** 1GG 1GG 1GG 1GG 95 92
Донорские лимфоциты 1GG 1GG 1GG 98 94 90
Примечание. Представлены результаты MTT-теста после 72-часовой инкубации клеток. "Выживаемость клеток, инкубированных без акадезина, принимали за 100%. Каждое значение - среднее пяти независимых опытов, стандартное отклонение < 0%. ""Пролиферацию фибробластов останавливали культивированием клеток до монослоя (контактное торможение деления клеток).
клетки Р388 (лейкоз мыши) и Sp2/0 (миелома мыши): при концентрации акадезина, равной 0.125 мМ, выживает ~1/3 клеточной популяции. Другие исследованные линии трансформированных клеток также гибнут под действием субмиллимолярных концентраций акадезина. Важно, что цитотоксичность акадези-на практически одинакова в случае лейкозной линии К562 и ее сублинии с Pgp-опосредованной МЛУ (К562/4). То же верно для линии аденокарциномы молочной железы MCF-7 и сублинии с МЛУ (табл. 1). Сравнение цитотоксичности акадезина в отношении линии НСТ116 и сублинии НСТ116р53КО (устойчивой к ряду ДНК-повреждающих противоопухолевых соединений) показало, что инактивация проапоп-тотического белка р53 не приводит к увеличению выживания клеток в присутствии акадезина.
Столь же важна существенно более высокая выживаемость неопухолевых клеток в присутствии акадезина: гибель донорских лимфоцитов и нетранс-формированных фибробластов практически отсутствовала даже при действии акадезина в миллимо-лярных концентрациях в течение 72 ч непрерывного воздействия (табл. 1). Таким образом, акадезин вызывает преимущественную гибель трансформированных клеток (суспензионных и эпителиальных), в том числе сублиний, устойчивых к другим противоопухолевым соединениям. Неопухолевые клетки повреждаются акадезином в значительно меньшей степени. Эти особенности обусловливают перспективность использования акадезина в качестве противоопухолевого средства. Однако для этого важно установление механизмов токсичности акадезина для опухолевых клеток.
Акадезин вызывает неапоптотическую гибель клеток
Влияние акадезина на распределение плоидно-сти клеток линии аденокарциномы толстой кишки НСТ116 изучено методом проточной цитофлуориме-трии. Через 24 ч после внесения акадезина (0.25 мМ) определяли накопление клеток в фазе S, а через 48 ч (рис. 1) - массовую гибель клеток (область слева от пика G1; гиподиплоидные ядра).
Накопление фрагментированной ДНК может быть признаком апоптотической гибели клеток, если расщепление ДНК происходит в межнуклеосомных промежутках, что видно по образованию набора фрагментов длиной 140-170 п.н. при электрофорезе. Для проверки этой возможности определяли целостность ДНК в клетках НСТ116, обработанных акадези-ном. Оказалось, что акадезин, в отличие от препарата сравнения - алкильного катионного глицеролипида , не приводит к появлению характерной для апоп-тоза «лестницы» фрагментов ДНК (рис. 2).
Флуоресценция
Рис. 1. Распределение клеток линии НСТ116 по фазам цикла при действии 0.4 мМ акадезина. А - интактные клетки; В - накопление в фазе S через 24 ч; В - накопление в области суб^1 через 48 ч
Аргументом в пользу неапоптотического механизма гибели клеток НСТ116 при действии акаде-зина служат результаты окрашивания клеток ан-нексином У-ФИТЦ и йодидом пропидия (рис. 3). Аннексин У связывает фосфатидилсерин на плазматической мембране (транслокация фосфатидил-серина из внутреннего липидного слоя мембраны
Рис. 2. Целостность ДНК в клетках линии НСТ116.
1 - Интактные клетки;
2 - акадезин, 0.4 мМ, 24 ч;
3 - алкильный катионный глицеролипид, 6 мкМ, 24 ч (контроль метода)
Рис. 3. Окраска клеток линии НСТ116 аннексином V-ФИТЦ и йодидом пропидия. Псевдоцвета: красный -интактные клетки; фиолетовый - акадезин (0.4 мМ, 24 ч); синий - алкильный катионный глицеролипид (контроль метода; см. подпись к рис. 2)
в наружный считается признаком апоптоза). Йодид пропидия способен проникать в клетки, подвергающиеся некрозу (нарушение целостности плазматической мембраны). Клетки линии НСТ116, обработанные акадезином (0.4 мМ, 24 ч), не окрашивались аннексином V-ФИТЦ; напротив, клетки накапливали йодид пропидия (рис. 3), что позволяет предположить некротический компонент механизма гибели. Сходные результаты получены при регистрации некротических клеток с помощью трипанового синего (данные не представлены). Вероятно, нарушение целостности плазматической мембраны - позднее событие при индуцированной акадезином гибели клеток. Препарат сравнения - алкильный катионный глицеролипид - вызывал характерное для апопто-за увеличение аннексин V-положительных клеток (рис. 3).
Поскольку апоптотическая гибель клеток предполагает активную роль каспаз, изучено действие пан-каспазного ингибитора zVAD-fmk на цитотоксичность акадезина. Клетки линии НСТ116 инкубировали с 200 мкМ zVAD-fmk в течение 30 мин, после чего в культуры вносили акадезин и продолжали инкубацию в течение 24 ч. Присутствие zVAD-fmk не снизило гибель клеток, что подтверждает заключение о неапоптоти-ческом механизме цитотоксичности акадезина.
Взаимодействие с рецепторами аденозина необходимо для гибели опухолевых клеток под действием акадезина
Перенос акадезина из внеклеточной среды в клетки может осуществляться транспортерами аденозина . Мы изучили эффект дипиридамола - ингибитора этих транспортеров, на цитотоксичность акаде-зина в линии клеток Р388. Оказалось, что в присутствии дипиридамола клетки нечувствительны даже к относительно высоким (до 0.8 мМ) концентрациям акадезина (табл. 2).
Для выяснения роли метаболического пути акадезин^МР-АМРК в цитотоксичности акадезина
Таблица 2. Цитотоксичность акадезина в комбинациях с дипиридамолом или 5-йодтуберцидином
Воздействие Акадезин, мМ
0 0.08 0.1 0.2 0.4 0.8
Акадезин 100* 79 З8 ЗЗ 20 18
Акадезин + дипиридамол, 5 мкМ 100 100 99 99 100 101
Акадезин + 5-йодтуберцидин, 0.05 мкМ 100 76 З9 З1 22 16
*Выживаемость (%) клеток лейкоза Р388 по данным МТТ-теста после инкубации в течение 72 ч.
(его фосфорилирование аденозинкиназой с образованием ZMP и активации AMPK) клетки инкубировали с акадезином и ингибитором аденозинкиназы 5-йодтуберцидином. Ингибитор не влиял на цитотоксичность акадезина (табл. 2). Из этого следует, что гибель клеток в ответ на акадезин не обусловлена образованием ZMP и активацией AMPK.
Таким образом, изучение механизмов цитотоксичности акадезина выявило ряд особенностей, указывающих на нетривиальный характер фармакологических эффектов этого соединения. Акадезин вызывает гибель культивируемых опухолевых клеток при существенно менее выраженном действии на неопухолевые. Акадезин токсичен для клеток с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости - экспрессией Pgp и нефункционирующим р53. Важно подчеркнуть неапоптотический характер гибели опухолевых клеток под действием акадезина. Эти результаты позволяют расценивать акадезин как своеобразный реагент для изучения механизмов гибели опухолевых клеток и перспективный кандидат в лекарственные средства.
Открытым остается вопрос о внутриклеточной мишени акадезина, взаимодействие с которой обусловливает гибель опухолевых клеток. Мы показали, что условием гибели клеток является функционирование транспортеров аденозина, тогда как активация АМРК не требуется. Правомерно предположить, что опухоли, экспрессирующие указанные транспортеры и рецепторы аденозина, будут наиболее чувствительны к акадезину. Роль транспорта пуриновых оснований в гибели клеток изучена недостаточно; требуется анализ дифференциальной экспрессии переносчиков и рецепторов аденозина в опухолях разного типа. Вероятно, повышенная экспрессия этих молекул окажется новым молекулярным маркером чувствительности опухолей к акадезину и критерием отбора больных для соответствующей терапии.
Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт № 16.N08.12.1010), а также частично поддержана Фондом некоммерческих программ «Династия».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Acadesine. AICA Riboside, ARA 100, Arasine, GP 1 110.
Drugs R D. 2008. V. 9. № 3. P. 169-175.
2. Jose C., Bellance N., Chatelain E.H., Benard G., Nouette-Gau-lain K., Rossignol R. // Mitochondrion. 2012. V. 12. P. 100-109.
3. Jose C., Hebert-Chatelain E., Bellance N., Larendra A., Su M., Nouette-Gaulain K., Rossignol R. // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1807. P. 707-718.
4. van den Neste E., van den Berghe G., Bontemps F. // Expert Opin. Invest. Drugs. 2010. V. 19. № 4. P. 571-578.
5. Javaux F., Vincent M.F., Wagner D.R., van den Berghe G. // Biochem. J. 1995. V. 305. P. 913-919.
6. Merrill G.F., Kurth E.J., Hardie D.G., Winder W.W. // Endocrinol. Metab. 1997. V. 273. № 6. P. 1107-1112.
7. Su R.Y., Chao Y., Chen T.Y., Huang D.Y., Lin W.W. // Mol. Cancer Therapy. 2007. V. 6. № 5. P. 1562-1571.
8. Theodoropoulou S., Kolovou P.E., Morizane Y., Kayama M., Nicolaou F., Miller J.W., Gragoudas E., Ksander B.R., Vavvas D.G. // FASEB. 2010. V. 24. P. 2620-2630.
9. The Handbook of Metabolomics. Methods in Pharmacology and Toxicology / Eds Whei-Mei Fan T. et al. 2012. V. 17. P. 439-480.
10. Walker J., Jijon H.B., Diaz H., Salehi P., Churchill T., Madsen K.L. // Biochem. J. 2005. V. 385. P. 485-491.
11. Campas C., Santidrian A.F., Domingo A., Gil J. // Leukemia. 2005. V. 19. P. 292-294.
12. Lopez J.M., Santidrian A.F., Campas C., Gil J. // Biochem. J. 2003. V. 70. P. 1027-1032.
13. Guigas B., Sakamoto K., Taleux N., Reyna S.M., Musi N., Viollet B., Hue L. // IUBMB Life. 2009. V. 61. № 1. P. 18-26.
14. Лобанов К.В., Эрраис Лопес Л., Королькова Н.В., Тяглов Б.В., Глазунов А.В., Шакулов Р.С., Миронов А.С. // Acta Naturae. 2011. T. 3. № 2 (9). С. 83-93.
15. Lysenkova L.N., Turchin K.F., Korolev A.M., Bykov E.E., Da-nilenko V.N., Bekker O.B., Trenin A.S., Elizarov S.M., Dezhen-kova L.G., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. // J. Antibiotics. (Tokyo). 2012. V. 65. № 8. P. 405-411.
16. Симонова В.С., Самусенко А.В., Филиппова Н.А., Тевяшо-ва А.Н., Лынив Л.С., Кулик Г.И., Чехун В.Ф., Штиль А.А. // Бюлл. эксп. биол. мед. 2005. Т. 4. С. 451-455.
17. Маркова А.А., Плявник Н.В., Плетнева М.В., Серебренникова Г.А., Штиль А.А. // Клин. онкогематол. 2012. Т. 5. № 2.
18. Shchekotikhin A.E., Glazunova V.A., Dezhenkova L.G., Shevtsova E.K., Traven’ V.F., Balzarini J., Huang H.-S., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. // Eur. J. Med. Chem. 2011. V. 46. P. 213-218.
19. Gadalla A.E., Pearson T., Currie A.J., Dale N., Hawley S.A., Sheehan M., Hirst W., Michel A.D., Randall A., Hardie D.G., Frenguelli B.G. // J. Neurochem. 2004. V. 88. P. 1272-1282.